本文介紹了一種以紅光半導(dǎo)體激光器作為熒光激發(fā)光源，結(jié)合光纖光譜技術(shù)測量水體中葉綠素α濃度的新方法。通過分析葉綠素α的激光光致發(fā)光機(jī)理，得出了水體中葉綠素α熒光發(fā)射光譜的相對熒光峰值強(qiáng)度與葉綠素α濃度的近似線性關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在紅光半導(dǎo)體激光器激勵(lì)下根據(jù)葉綠素α的熒光發(fā)射光譜直觀地判斷葉綠素α的濃度這種方法完全可行，由此為研制葉綠素α熒光儀提供了一種新的光源選擇，并為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場實(shí)時(shí)監(jiān)測海水中葉綠素α濃度提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

　　隨著國內(nèi)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，污染越來越嚴(yán)重，環(huán)境問題越來越受到人們的關(guān)注。水是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，水質(zhì)的好壞直接關(guān)系到人類的生存和健康。浮游植物是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最主要的初級(jí)生產(chǎn)者和能量的主要轉(zhuǎn)換者，浮游植物生物量的多少?zèng)Q定了海區(qū)內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)的群落結(jié)構(gòu)和能量分布狀態(tài)。因此，海水中浮游植物的濃度是判斷水質(zhì)好壞的重要依據(jù)。通常采用測量水體中葉綠素α濃度的方法來獲得海水中浮游植物的濃度。由于水體中葉綠素α的濃度反映了浮游植物的濃度，因此是環(huán)保部門監(jiān)測水質(zhì)狀況的重要指標(biāo)之一，同時(shí)還可通過海水中葉綠素α濃來估算海洋初級(jí)生產(chǎn)力。因此，水體中葉綠素α濃度的測量就顯得尤為重要。

　　長期以來，對水體中葉綠素α濃度的常用測量方法主要有分光光度法和熒光分析法兩種。無論哪種方法，由于葉綠素?zé)晒庑盘?hào)很弱，需要一個(gè)高強(qiáng)度、無背景干擾且穩(wěn)定輸出的激勵(lì)光源；而人們采用的激勵(lì)光源多為傳統(tǒng)的復(fù)色光源(包括汞燈、氙燈、各種等離子體光源等)，需要采取濾光、信號(hào)放大、去噪聲等一系列措施，這無疑使系統(tǒng)結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜，不利于現(xiàn)場實(shí)時(shí)測量。而由于激光具有很高的能量峰值和很窄的脈沖寬度，一般由激光誘導(dǎo)熒光測量物質(zhì)的特性比由一般光源誘導(dǎo)熒光所測的靈敏度提高2倍～10倍。目前國內(nèi)外已有一些研究者采用激光作為激勵(lì)光源，但普遍采用能耗較高且價(jià)格昂貴的藍(lán)綠光?，F(xiàn)率先采用低能耗的紅光半導(dǎo)體激光器作為激勵(lì)光源，并結(jié)合光纖光譜技術(shù)以提高接受信號(hào)的能力，最終使系統(tǒng)具有高靈敏度、低能耗、小型化、易集成化等特點(diǎn)。

　　1.理論分析

　　當(dāng)特定波長的光子(單色激發(fā)光)被所照射的分子吸收后，分子的電子能級(jí)發(fā)生躍遷而處于激發(fā)態(tài)，而激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，在適當(dāng)條件下如果這部分被吸收的能量又以輻射形式重新回到基態(tài)，這就是光致發(fā)光。對于葉綠素分子來說，當(dāng)葉綠素α分子部分或全部吸收其特征吸收波段的光子，就由最穩(wěn)定的、能量最低的狀態(tài)-基態(tài)上升到不穩(wěn)定的高能狀態(tài)-激發(fā)態(tài)，而激發(fā)態(tài)分子極不穩(wěn)定，會(huì)在極短的時(shí)間內(nèi)(10-12s)無輻射躍遷到亞穩(wěn)態(tài)能級(jí)，處于亞穩(wěn)態(tài)的電子躍遷到基態(tài)(10-8s)并釋放出熒光。

        葉綠素α分子有紅光和藍(lán)光兩個(gè)最強(qiáng)吸收區(qū)，由于它吸收的光能有一部分消耗在分子內(nèi)部的振動(dòng)上，且熒光又總是從第一單線態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)輻射的，輻射出的光能必定低于吸收的光能，因此葉綠素的熒光的波長總要比被吸收的波長長些。葉綠素α在吸收特定波長的激發(fā)光后發(fā)射出比激發(fā)光波長更長的熒光，通常直觀地用葉綠素α的熒光發(fā)射光譜來描述。只要激勵(lì)光的光強(qiáng)穩(wěn)定，熒光光強(qiáng)僅與葉綠素α的濃度有關(guān)。對水體中的葉綠素α來說，在某一特定波長的光激發(fā)后，所發(fā)射的熒光強(qiáng)度為：

　　式(1)中：k為儀器常數(shù)；Q為物質(zhì)熒光效率；I0為激勵(lì)光光強(qiáng)；c為物質(zhì)濃度；b為樣品光程差；ε為摩爾吸收系數(shù)。當(dāng)所測量的熒光物質(zhì)確定后，k，Q，I0，b，ε均為常數(shù)，則c與F成一定數(shù)學(xué)關(guān)系。對上式進(jìn)行分析可知，當(dāng)溶液很稀時(shí)，εcb很小，則上式指數(shù)部分近似為1-εcb，相應(yīng)的F=kQI0εbc=ωc(其中ω=kQI0εb，在激勵(lì)光光強(qiáng)穩(wěn)定時(shí)是常數(shù))，即此時(shí)葉綠素α濃度與相對熒光光強(qiáng)近似成線性關(guān)系。因此在同一穩(wěn)定的激發(fā)光激勵(lì)下，可以根據(jù)葉綠素α的熒光發(fā)射光譜方便直觀地判斷葉綠素α的濃度。

2.實(shí)驗(yàn)方法與數(shù)據(jù)分析

　　實(shí)驗(yàn)中采用激光誘導(dǎo)熒光(LIF)與光纖光譜技術(shù)結(jié)合來測量水體中葉綠素α的熒光發(fā)射光譜。實(shí)驗(yàn)所用主要儀器有：美國海洋光學(xué)公司生產(chǎn)的HR-2000系列光纖光譜儀，輸出功率10mW的紅光半導(dǎo)體激光器(660nm)，計(jì)算機(jī)，量筒，無水乙醇，器皿等。實(shí)驗(yàn)裝置示意圖如圖1所示：

　　實(shí)驗(yàn)具體過程如下：用圖1所示實(shí)驗(yàn)裝置先測得不放葉綠素樣品時(shí)乙醇溶液在激光照射下的透射光譜，如圖2所示；采集新鮮樹葉若干，剪碎研磨后用高純度的無水乙醇5ml配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度記為c0，用相同實(shí)驗(yàn)裝置測得該濃度下葉綠素α的熒光發(fā)射光譜，相對熒光峰值強(qiáng)度記為F0；然后逐步添加無水乙醇稀釋成6ml、8ml和10ml的三種不同濃度的溶液，稀釋后的溶液濃度依次記為5c0/6、5c0/8和c0/2，用相同的方法分別測得不同濃度下對應(yīng)的熒光發(fā)射光譜，相應(yīng)的熒光峰值強(qiáng)度記為F1、F2和F3，測得熒光發(fā)射光譜和實(shí)驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)分別如圖3，表1所示：

　　比較圖2，圖3可以看出，圖2只有一個(gè)峰(660nm)，實(shí)際上是激勵(lì)光的光譜。兩者區(qū)別在于加入葉綠素樣品后在685nm附近明顯出現(xiàn)了一個(gè)熒光峰，由此可以判斷其為葉綠素α所產(chǎn)生的熒光。由于不同濃度的葉綠素α在685nm處均有一個(gè)明顯的熒光發(fā)射峰，且峰值強(qiáng)度隨濃度的減小而降低；兩者的具體關(guān)系通過分析表1中數(shù)據(jù)可看出，葉綠素α的相對熒光峰值強(qiáng)度與其濃度近似成線性，這與理論相吻合，因此可以通過獲取葉綠素α的熒光發(fā)射光譜來估算水體中葉綠素α的濃度。

3.結(jié)論

　　首次提出用紅光半導(dǎo)體激光照射葉綠素α溶液產(chǎn)生光致發(fā)光的新方法，通過實(shí)驗(yàn)觀察到熒光光譜的峰值波長在685nm附近，且峰值高度與葉綠素濃度近似成線性關(guān)系，為實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場監(jiān)測海水中葉綠素α的濃度提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：只需探測熒光光譜中685nm峰值的相對強(qiáng)度，即可快速測定葉綠素α的濃度；由于采用紅光半導(dǎo)體激光作為激發(fā)光源，避免了對熒光發(fā)射光譜造成背景噪聲，因此靈敏度高，精確性好，克服了傳統(tǒng)方法的局限性；此外，半導(dǎo)體激光器體積小、功耗低，便于研制集成化的測量儀器。