之所以能夠在更深層次的組織中成像，是因為生物樣品的光散射大部分是米氏散射，正比于1/λ4。因此，即使激發(fā)波長有一個很小的增加（如幾十個納米），也會導(dǎo)致散射部分極大的減少，這已被證明是在深組織成像中限制信噪比的一個重要因素。

　　使用更長波長同樣能減少光損傷。例如，曾有研究人員證實，在大多數(shù)植物標(biāo)本上通過緊聚焦，可以使用平均輸出功率超過100mW的1280nm激光束安全地觀察到持續(xù)的多光子光譜。在同一項研究中，研究人員還發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用波長830nm、平均功率大于10mW的鈦寶石激光束緊聚焦照射樣品時，通常在一秒鐘之內(nèi)就會觀察到由多光子吸收激發(fā)引起的破壞性等離子體的形成。在一項胚胎研究中[2]，研究人員指出：“很明顯，使用800nm和1250nm高強度光激發(fā)有顯著的不同。較長波長對胚胎的損傷更小，可以認(rèn)為是安全輻射。”因此，較長波長同樣實現(xiàn)了高功率激光的安全使用，這反過來又促進(jìn)了最大可能的成像深度。

　　靈活的波長調(diào)諧實現(xiàn)多模式成像

　　目前有各種各樣的非線性激發(fā)技術(shù)，每一種都適于對不同種類的生物分子和微結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像。例如，相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）通常是通過在2840cm-1附近激發(fā)它們的CH延展振動、從而為脂類成像提供最佳方法。另一方面，多光子激發(fā)（MPE）是用于激發(fā)熒光蛋白、傳統(tǒng)染色劑和內(nèi)源性熒光樣品熒光的理想方式。而二次諧波和三次諧波技術(shù)最適用于膜、膠原蛋白和肌纖維，同樣也能用于一些脂類。因此，研究人員經(jīng)常想在同一個樣品上同時使用這幾種不同的方法（見圖2），或者利用兩個不同波長進(jìn)行多光子激發(fā)（MPE）。這被稱作多模式成像，理想的激發(fā)光源需要有兩個獨立可調(diào)諧的輸出波長。

　　圖2：多模式成像案例--偽彩色果蠅幼蟲全身成像。紅色是無標(biāo)記CARS信號，綠色是雙光子熒光信號。

        滿足顯微鏡成像的需求

　　為了滿足長波長激發(fā)的需求，首先要擴(kuò)展自動鈦寶石激光器的調(diào)諧范圍。具體來說，當(dāng)輸出波長超過1000nm時，鈦寶石的增益便會逐步下降。然而，調(diào)諧范圍是可以通過減少損耗和增加泵浦功率來擴(kuò)展的。例如，相干公司最新的ChameleonVision系列激光器使用的寬帶光學(xué)元件具有極低的散射和吸收，配合使用相干公司獨特的18W、532nm泵浦激光器，實現(xiàn)了波長范圍680~1080nm的一鍵式調(diào)諧。

　　隨著緊湊型光學(xué)參量振蕩器的不斷發(fā)展，如相干公司的ChameleonCompactOPO，人們對使用波長大于1080nm激光的興趣也在不斷增加。通過使用集成式控制器即可輕松將波長調(diào)諧至1600nm，操作非常簡便。此外，使用可選的fan-poledOPO晶體，可以讓鈦寶石激光器和OPO在不改變光束指向的條件下實現(xiàn)獨立調(diào)諧，這對于多模式成像是非常理想的?，F(xiàn)在又增加了一個將OPO輸出倍頻得到可見光的選項，進(jìn)一步增加了多模式成像的選擇（見圖3）。

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　　圖3：Fan-poled晶體的使用，使得鈦寶石振蕩器與OPO能夠?qū)崿F(xiàn)獨立的大范圍波長調(diào)諧。OPO的輸出倍頻進(jìn)一步擴(kuò)展了多模式成像能力。圖中顯示了熒光體與成像技術(shù)是如何通過多模式成像來相互匹配的。藍(lán)色線條代表了頻率間隔為2840cm-1的脂類CARS成像。

　　非線性或多光子成像是超快激光器的重要應(yīng)用之一。激光器制造商正在從操作的簡便性、調(diào)諧范圍和系統(tǒng)靈活性這幾個方面不斷改進(jìn)超快激光器產(chǎn)品，進(jìn)一步支持該領(lǐng)域的發(fā)展。