流式細(xì)胞術(shù)是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)中一項的基礎(chǔ)技術(shù)，這個技術(shù)是使用激光來激發(fā)附著于細(xì)胞的分子熒光標(biāo)記，并用光電倍增管（PMT）和其他光感測技術(shù)對其探測（見圖一），將細(xì)胞以流體動力聚集的液體流的方式引入激光束。


圖一。解析圖顯示基本流體細(xì)胞術(shù)的運作方式，通過流體動力聚焦，將細(xì)胞通過管口或封閉石英流動池引入液體流中的激光束。采集信號的光學(xué)元件負(fù)責(zé)采集被激發(fā)的熒光信號，然后這些信號會通過分色鏡和窄帶通濾波器導(dǎo)入光電倍增管?，F(xiàn)代的儀器可以把光纖用于激光傳輸和信號收集。

一些流體細(xì)胞儀只能分析那些附在細(xì)胞表面或者在細(xì)胞內(nèi)部的熒光標(biāo)記。 在熒光 一 激活細(xì)胞分類器中（FACS），液體流分裂成液滴然后液滴產(chǎn)生靜電荷然后轉(zhuǎn)移到收集管里。細(xì)胞分選使基于熒光標(biāo)記的細(xì)胞能分離和被收集，能使被收集的細(xì)胞可以用于功能研究和蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組分析。

激光應(yīng)用在流式細(xì)胞術(shù)的背景

流式細(xì)胞術(shù)依靠激光技術(shù)來激發(fā)熒光標(biāo)記是毫無疑問的1，最早的流體細(xì)胞儀采用單束激光器（當(dāng)時通常為大型水冷離子激光器）來激發(fā)最多一到兩個熒光探針，其中包括像熒光黃和若丹明的熒光素。當(dāng)下的流體細(xì)胞儀采用波長從紫外線（大約355nm）到長紅外線（大約700nm）橫跨整個可見光譜的固體激光器。

高級流式細(xì)胞儀可以裝備多大十個不同的單波長激光器，使很多種類的有著不同激發(fā)/發(fā)射特性的熒光探針能夠被激發(fā)。早期的儀器只能激發(fā)和探測一到兩個探針，而現(xiàn)在在高端的儀器上，同時偵測三十個甚至更多的熒光探針都已經(jīng)成為可能，這個高維分析已經(jīng)把我們對免疫系統(tǒng)的認(rèn)知擴大到了前所未有的程度。

當(dāng)前的流式細(xì)胞儀用許多激光波長和相對應(yīng)的熒光探針對二十個或以上的細(xì)胞特征進(jìn)行同步分析，這些先進(jìn)的儀器通常會裝備一個氰激光器（488nm）、一個紅激光二極管（約640nm）、和一個綠、綠黃、或黃色二極管泵浦固體激光器（532/552/561nm），這些激光器都可以激發(fā)多種熒光素（見圖二）。


圖二：一個在流式細(xì)胞術(shù)中與能達(dá)到激發(fā)要求的激光波長配對的熒光探針的樣本。這些探針絕大多數(shù)都在光譜上兼容而且可以同時與足夠多的激光波長使用在儀器上。（BB：亮藍(lán)、BYG：亮黃綠、BV：亮紫、和BUV:亮紫外線染料是BD Sirigen的注冊商標(biāo)，而Pacific Blue，Alexa Fluor 647和Alexa Fluor 790是Thermo Fisher公司的注冊商標(biāo)。）

隨著BD Sirigen的亮紫（BV）聚合物染料的發(fā)展，紫色激光二極管成為了重要的激發(fā)手段2。可以使用七種BV染料（BV421，BV480，BV570，BV605，BV650和BV787）進(jìn)行光譜兼容、顯著增加可分析的同步細(xì)胞標(biāo)記的數(shù)量。紫外線（UV）激光器在流式細(xì)胞儀中已經(jīng)越來越重要，最近開發(fā)的六種亮光紫外線染料（BUV395，VUV496，BUV563，BUV661，BUV737和BUV805），將同步熒光分析的總數(shù)接近30。目前，紫外激光已經(jīng)成為了高級流式細(xì)胞術(shù)儀器使用中的一個關(guān)鍵部分。

當(dāng)前的流式細(xì)胞儀主要依靠三倍頻率摻雜釹的釩酸鹽（Nd：YVO4）355 nm固體激光器來激發(fā)BUV和其他紫外線激發(fā)染料，這些激光器相對于以前需要提供UV激發(fā)的氬離子和氪離子激光器而言是相當(dāng)大的進(jìn)步，因為它們體積更小并且更容易維護(hù)。然而，這些激光器還是很昂貴的，而且是高端儀器中成本最高的單個部件。

許多UV激發(fā)染料（包括BUV）可以代替355納米的較低成本的近紫外激光二極管（375nm）3。 然而，它們的波長非常接近BUV395的發(fā)射范圍，這是系列中最短的，使其難以檢測。 因此，需要相對便宜的固態(tài)紫外激光來降低高維流式細(xì)胞儀的成本。

簡潔型320 nm激光模組

但是隨著近來在由LASOS（德國）開發(fā)的在小型風(fēng)冷組件中連續(xù)波（CW）發(fā)射的小型固體320nm激光模組的發(fā)展，情況已經(jīng)改變了。流式細(xì)胞儀在過去曾被裝備過氦鎘激光器，利用其325nm的激光線來激發(fā)紫外染料。 然而，氦鎘激光器不僅體積龐大，而且功率還不夠，另外時間長了還會產(chǎn)生噪聲。320nm光源的波長與傳統(tǒng)的325nm波長非常接近，并且從激發(fā)光譜的角度來看，應(yīng)該能相當(dāng)不錯地激發(fā)BUV染料。

為了測試不論激光波長或光源是否適合應(yīng)用在流式細(xì)胞術(shù)上，一個320nm激光模組代替?zhèn)鹘y(tǒng)325nm紫外激光安裝在了一個BD LSR II流式細(xì)胞儀上（見圖三）4，然后將激光對準(zhǔn)用于將細(xì)胞注入激光路徑的液體流。最初配置為355 nm激光源的儀器的光學(xué)元件保持有效范圍低至320 nm，寬帶UV鏡用于將激光轉(zhuǎn)向樣本流和熔融石英透鏡以聚焦光束。

圖3. LASOS 320 nm激光模組非常簡介（a）。 用20mW的320（最高）或355nm（最低）激光源分析InSpeck Blue（b）微球混合物（7個群體）。 以20mW的320（最高）或355nm（最低）激光源分析用BUV563或BUV661標(biāo)記的小鼠脾細(xì)胞（c和d）。 彩色痕跡表示標(biāo)記的細(xì)胞，而灰色跡線表示未標(biāo)記的對照。 用于InSpeck Blue微球BUV463和BUV661標(biāo)記細(xì)胞的帶通濾光片的光譜曲線顯示在直方圖下。 （圖片由William Telford提供）

流式細(xì)胞術(shù)使用熒光染料標(biāo)記的聚合物微球作為模擬樣本，以確定儀器操作是否最佳，并測試新的激光源。 還分析了明亮和暗淡的紫外線激發(fā)微球（InSpeck Blue microspheres; Thermo Fisher，Eugene，OR）的混合物 - 最暗淡的群體的分辨率是良好的激發(fā)和檢測的指標(biāo)。 這些微球，包括最小的群體，可以很容易地用圖3b激光源解決。 靈敏度與相同功率水平的355nm激光器相似。 然后使用與BUV563和BUV661（兩種BUV染料）偶聯(lián)的抗體將小鼠脾細(xì)胞標(biāo)記為細(xì)胞表面標(biāo)志物。 320nm模組激發(fā)這些樣品幾乎與355nm的激光源效果一樣（參見圖3c和3d）。 

因此，這證明了LASOS 320nm激光源能在流式細(xì)胞術(shù)中良好地替代355nm激光源激發(fā)。 這些激光模組比大多數(shù)355 nm光源更小，成本更低，使其成為高維流式細(xì)胞術(shù)有效的低成本替代品。 在這個范圍內(nèi)和整個可見光譜范圍內(nèi)的小型固態(tài)激光源已經(jīng)徹底改變了流式細(xì)胞術(shù)，降低了現(xiàn)代儀器對尺寸，成本和維護(hù)的需求。 這是科技發(fā)展中一個令人鼓舞的趨勢，并將繼續(xù)為更好的生物醫(yī)學(xué)分析儀器做出貢獻(xiàn)。

1. W. G. Telford, Methods Cell Biol., 102, 375–410 (2011); doi:10.1016/b978-0-12-374912-3.00015-8.

2. P. K. Chattopadhyay et al., Cytometry A, 81, 456–466 (2012).

3. W. G. Telford, Cytometry A, 87, 1127–1137 (2015).

4. W. G. Telford, L. Strickland, and M. Koschorreck, Cytometry A, 91, 314–325 (2017).


翻譯/Nick
文章來源：LaserFocusWorld